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聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的研制與分析

聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的研制與分析
发布人:晶华净水      发布时间:19-01-18       浏览次数:
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。它在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后,蛋白质亚基的点泳迁移率主要取决于亚及分子量的大小,而电荷因素可以被忽略。当蛋白质的分子量在15KD到200KD之间时,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系,可以用来测定蛋白质亚基的分子量。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺(CH2=CHCONH2 Acrylamide)和甲叉双丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N’-methylenebisacrylamide)聚合而成,这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种:化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵(AP)以及加速剂四甲基乙二胺(TEMED),四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基:以R·代表自由基,M代表丙烯酰胺单体,这样由于乙烯基”CH2=CH-”一个接一个的聚合作用就形成丙烯酰胺长链,同时甲叉双丙烯酰胺在不断延长的丙烯酰胺链间形成甲叉键交联,从而形成交联的三维网状结构。氧气对自由基有清除作用,所以通常凝胶溶液聚合前要进行抽气。丙烯酰胺的另一种聚合方法是光聚合,催化剂是核黄素,核黄素在光照下能够产生自由基,催化聚合反应。一般光照2-3小时即可完成聚合反应。
聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质最初是在玻璃管中进行的,玻璃管通常直径为7 mm,长10 cm,将凝胶装入到多个管中进行电泳,又称为柱状电泳。目前仍有应用,尤其用于二维电泳中的第一维电泳。但由于各个玻璃管的不同以及装胶时的差异使每管的分离条件会有所差异,所以对各管样品进行比较时可能会出现较大误差。后来发展起来的垂直平板电泳一次最多可以容纳20个样品,电泳过程中样品所处的条件比较一致,样品间可以进行更好的比较,重复性也更好,所以垂直平板电泳目前应用的更为广泛,常用于蛋白质及DNA序列分析过程中DNA片段的分离、鉴定。
水平平板電泳近年來也有很快的發展,與垂直平板電泳相比也有其獨特的優點:①由于凝膠可以直接鋪在冷卻板上,容易使凝膠冷卻,因而可以加高電壓以提高分辨率。②電泳速度快,通常只要1小時左右,而園盤電泳和垂直平板電泳一般需要3~4小時。③因爲可以使用薄膠,加樣少,染色快,從而提高了靈敏度,而且容易保存,只要用甘油浸泡後自然幹燥即可長期保存不會龜裂。④便于適用各種電泳方式,用途廣泛,尤其是可以使用90年代才發展起來的只有水平電泳系統才能使用的新的半幹技術,即用浸有少量緩沖液的半幹的膠條代替通常所用的大量電極緩沖液,大大節約了試劑,簡化了操作,提高了電泳速度。
聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制,丙烯酰胺的浓度可以在3%-30%之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径,如3%的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用,可用于平板等电聚焦或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶,也可以用于分离DNA;高浓度凝胶具有较小的孔径,对蛋白质有分子筛的作用,可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中,如10%-20%的凝胶常用于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔径大小均取决于两个重要参数T和C,T是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分浓度。T与C的计算公式是: C = 6.5-0.3T
上式中a为丙烯酰胺的克数,b为甲叉双丙烯酰胺的克数,m为水或缓冲液体积(ml)。式中a与b的比例很重要。富有弹性,且完全透明的凝胶,a与b的重量比应在30左右。选择T和C的经验公式是: C = 6.5-0.3T此式可用于计算T为5%~20%时的凝胶组成。C值并不很严格,在大多数情况下,可变化的范围约为 ±1%,当C保持恒定时,凝胶的有效孔径随着T的增加而减小,当T保持恒定,C为4%时,有效孔径最小,C大于或小于4%时,有效孔径均变大,C大于5%时凝胶变脆,不宜使用,实验中最常用的C是2.6%和3%。
操作流程:
1.安裝灌膠模具,依照說明書進行
2.按照配方配置一定量(7cm模具配置1mm厚的膠配置5ml)的分離膠溶液和濃縮膠溶液(2ml),過硫酸铵和TEMED在用前加入。
3.分離膠溶液充分混勻後從一側加入灌膠模具,上方留約1.5-2cm用于加濃縮膠,小心的在分離膠的表面加一層水飽和正丁醇(或水飽和的異丙醇、水),封住膠面,以促使聚合並保持膠面平整。
4.室溫放置40分鍾到1小時後,可以看到一個界面,去掉上層覆蓋液,用濃縮膠緩沖液淋洗膠面,然後灌制濃縮膠,並插入與模具大小相同,凝膠厚度相當的梳子。
5.靜止放置40-60分鍾使凝膠聚合,電泳液清洗樣品孔。
6.制备好的蛋白质样品用2Xloading buffer 1:1混合,与分子量marker 一起100℃煮3-5min, 12000rpm离心5-10min,(7cm模具、1mm厚度、10孔、考染上样量30ug)
7.加入下槽液,把夾有凝膠的玻板轉移到電泳槽,加入上槽液,上樣。
8.連接電源,5-10mA/膠開始電泳,待溴酚藍前沿到達分離膠後加大電流到10-15mA/膠,
9.溴酚藍前沿到達玻璃板底部時停止電泳,取出凝膠,做好標記,准備染色。
10.染色。見考馬斯亮藍染色操作規程及銀染色操作規程。
11.掃描。掃描操作見掃描儀的使用說明。
由于聚丙烯酰胺凝胶有突出的优点,因而四十年来得到广泛的应用,目前尚无更好的支持介质能够取代它。其主要的优点有:①可以随意控制胶浓度”T”和交联度”C”,从而得到不同的有效孔径,用于分离不同分子量的生物大分子。②能把分子筛作用和电荷效应结合在同一方法中,达到更高的灵敏度:10-9 ~10-12 mol/L。③由于聚丙烯酰胺凝胶是由-C-C-键结合的酰胺多聚物,侧链只有不活泼的酰胺基-CO-NH2 ,没有带电的其他离子基团,化学惰性好,电泳时不会产生”电渗”。④由于可以制得高纯度的单体原料,因而电泳分离的重复性好。⑤透明度好,便于照相和复印。机械强度好,有弹性,不易碎,便于操作和保存。⑥无紫外吸收,不染色就可以用于紫外波长的凝胶扫描作定量分析。⑦还可以用作固定化酶的惰性载体。
注意事項
1.在加過硫酸铵和TEMED之前溶液最好抽氣,防止溶解在溶液裏的分子氧在聚合時産生氣泡使膠不均一。
2.過硫酸铵和TEMED的量應根據室溫和聚合情況而定。
3.分離膠聚合後最好在4℃放置12小時後再使用,以使凝膠充分聚合,改善電泳時的分辨率。
4.爲防止氣泡陷入,梳子應傾斜插入。
5.如果帶著梳子過夜可能會影響分辨率,所以濃縮膠最好在使用前再灌制。
6.如果沒有足夠數目的樣品,應在加樣孔中加樣品緩沖液,不要留有空孔,以防止電泳時鄰近的帶擴展。
7.對樣品濃度不確定的情況下,加樣時使用梯度加樣法,能大致估計出樣品的濃度。
配成30%的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1個月,在貯存期間丙烯酰胺會水解爲丙烯酸而增加電泳時的電內滲現象並減慢電泳的遷移率。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是一種對中樞神經系統有毒的試劑,操作時要避免直接接觸皮膚,但它們聚合後則無毒。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷,它們的分離是依據其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用,因而可以得到較高的分辨率,尤其是在電泳分離後仍能保持蛋白質和酶等生物大分子的生物活性,對于生物大分子的鑒定有重要意義,其方法是在凝膠上進行兩份相同樣品的電泳,電泳後將凝膠切成兩半,一半用于活性染色,對某個特定的生物大分子進行鑒定,另一半用于所有樣品的染色,以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量。

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